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pcr过程中加入模板的量是多少

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= =+关键是PCR引物.引物!生物选修3 , 同一物种,标准曲线用cDNA测得 , 之前都是用提取基因组DNA作为模板,体系是优化好的,这次自行设计引物扩增一1300bp左右大小的基因,用cDNA(RNA反转录)为模板先摸索退火温度,反应体系怎样合适?或者怎样设计体系(主要指量和整体体系)? 酶:用的普通Tag酶 , 引物是否只与首末端结合,详细原因 ...

聚合酶和模板的量会影响pcr突变的结果么?: pcr突变主要是酶造成的,用高保真酶可以保证突变非常少也可能没有突变

PCR技术引物原则: 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction , PCR)是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作的基础。在这三种技术中,PCR方法理论上出现最早,实践中应用也最广泛。PCR技术使对微量的核酸(DNA或RNA)操作变得简单易行,同时还可以使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命,它极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。
PCR技术发展简史
人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初,人们致力于研究基因的体外分离技术。但是,由于核酸的含量较少,一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是,当时的基因序列分析方法尚未成熟,对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现,寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段,这种想法似乎没有任何实际意义。
1985年,美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下,经过两年的努力,发明了PCR技术,并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此,PCR技术得到了生命科学界的普遍认同,Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。
但是,最初的PCR技术相当不成熟,在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初,Keohanog通过对所使用的酶的改进,提高了扩增的真实性。尔后,Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶,使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用,使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。在以后的几十年里,PCR方法被不断改进:它从一种定性的分析方法发展到定量测定;从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止,PCR技术已有十几种之多,例如,将PCR与反转录酶结合,成为反转录PCR,将PCR与抗体等相结合就成为免疫 PCR等。
PCR技术的基本原理和操作
1. PCR的基本原理
PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程,可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面,新合成的DNA片段也可以作为模板,因而 PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。
2. PCR的基本成分
PCR包括7种基本成分:模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。
模板DNA:包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。除此之外,PCR反应还可以直接以细胞为模板。
特异性引物:是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段,对于DNA的扩增起到引发的作用。
热稳定DNA聚合酶:这是PCR技术实现自动化的关键。热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的:一类是嗜热和高度嗜热的真细菌,另一类是嗜热古细菌。现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。
脱氧核苷三磷酸(dNTP):是DNA合成的原料,包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。
二价阳离子:常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。
缓冲液:一般使用Tris-Cl缓冲液,标准的为10mmol/L,并将其调节到8.3~8.8之间。
一价阳离子:一般使用50mmol/L的KCl溶液,有利于改善扩增的产物质量。
PCR的基本操作
PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成:
1. 变性:通过加热使模板DNA完全变性成为单链,同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除;
2. 退火:将温度下降至适宜温度,使引物与模板DNA退火结合;
3. 延伸:将温度升高,热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。
以上三部为一个循环,新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板,经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要应用
最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。因为在PCR方法问世以前,要获得一个靶基因,必须建立基因文件库,然后从成千上万的菌落中通过 Southern blot 杂交筛选含有靶基因的克隆。这样既费时又费钱,特别是在克隆真核生物基因时难度更大。自从建立了PCR方法以后,使克隆已知序列的基因变得非常容易。为了适应分子生物学的快速发展,PCR方法也得到了不断发展,现在PCR已应用到生命科学的各个领域。
1. 基础研究方面的应用
目前从事分子生物学的实验室和研究人员,几乎每天都在使用PCR,可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此,PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法,可用于达到以下目的:
l 扩增目的基因和鉴定重组子;
l 克隆基因;
l 基因功能和表达调控的研究;
l 基因组测序;
l 制备单链模板;
l 致突变;
2. PCR在临床上的应用
l 在遗传学上的应用:人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变,使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点,通过PCR结合限制片段长度多态性分析(PCR-RFLP),就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如,血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病,患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变,产生了一个新的PstI酶切点,因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。
l 在肿瘤研究中的应用:PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如,差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物,并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面,在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶,以进一步改进治疗方案。此外,由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化,因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。
l 检测病原体
l 在基因分型中的应用:当进行器官移植时并须先组织配型工作,此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR(PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP)对人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)进行分型,使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。
3. 在法医学中的应用
例如:最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异,因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外,可变数目串联重复序列(variable number tandem repeat,VN-TR)PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。
所以,综上所述,PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN- TR,以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因,并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说,PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信,在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善,PCR技术也将发挥着越来越重要的作用。

荧光定量PCR的模板可以是DNA吗?内含子对其有无影响?: 在实时荧光PCR中。模板的定量有2种方法:绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过已知的标准曲线来确定我们所感兴趣基因的拷贝数;
相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化.
如果你做的是DNA的定量,可以用DNA 模板。你用质粒作为标准品做标准曲线,最后可以换算出来拷贝数,这是绝对定量。

如果是做转录,表达量的变化,需要提取RNA,反转录为cDNA,然后再做相对定量。

PRPF 40A在什么类型细胞内表达量大,最近利用cDNA做模板进行PCR老是没办法p出来。: 到NCBI查一下就知道哪个组织有表达了。
另外,知道序列的话,可以直接合成。不太长的话,费用可能比PCR还要便宜。
也可以到一些生物公司去买DNA模板质粒。

关于PCR中用cDNA做模板扩基因的最优体系: 如果仅仅是摸一个比较适合的退火温度的话,用一个通用的tag buffer体系就行,退火温度的确定主要考虑的是引物的GC含量及目的基因的Tm值

以基因为模板,pcr方法获得基因,运用puc18载体说明克隆和筛选过程: 根据基因,用Primer Premier 5 软件设计引物合成引物。利用高保证酶进行PCR扩增,扩增产物经纯化或胶回收得到目的片段。将目的片段、载体、Buffer按使用说明混合均匀过夜。经转化(重组载体加入感受态细胞,冰浴30min,42度热激90s,加入LB培养1.5--2h,收集菌体涂平板)14-16h后挑取单克隆培养4-6h后即可通过PCR进行阳性克隆的检测。

PCR中引物是怎样引入的(与特定模板链结合): 这要看你所设计的引物了,引物不同,它结合的位置也不同。在PCR中,94度的变性使DNA双链成为单链,50度左右的复性使引物结合到模板链上,复性温度要根据引物的Tm值。所以引物不是说只与首末端结合。

看我的PCR扩增产物跑的电泳,其中一个为什么没跑出来,怎么判断DNA模板是不是有问题: 电泳图为什么没贴上来?
没跑出来的因素很多。别的都有就这一个没有的话,首先考虑肯定是模板有没有问题。其次机器和试剂还有PCR管是不是够干净或者够稳定。最后考虑有没有加错。
要判断模板有没有问题,你就按照之前的试验方案,就拿这一个样品,做梯度试验,做三四个样就可以了吧,同时拿上次做出来了的做对照。如果这次能出来,就说明模板没问题,是别的原因。如果还没有,就考虑模板有问题了。

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